Nghiên cứu chuyển hóa rutin thành isoquercetin bằng vi sinh vật và ứng dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng

Rutin được chiết xuất từ hoa Hòe (Sophora japonica L.) là sản phẩm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và dược lý cao. Trong nhóm các chất flavonoid này gồm rutin, quercetin và isoquercetin có tác dụng chống oxy hóa mạnh, kháng viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa tế bào ung thư. Nhiều công bố về công dụng của isoquercetin có hiệu quả ngăn ngừa phát triển của tế bào ung thư mạnh hơn các flavonoid khác, đặc biệt là ở ung thư đại tràng, ung thư vú và ung thư gan.

Với tác dụng tốt cho sức khỏe, isoquercetin ngày càng được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới, isoquercetin được xem là hợp chất có tiềm năng với độ hòa tan trong nước cao hơn so với quercetin đồng thời tính khả dụng sinh học dược chứng minh cao hơn nhiều rutin và quercetin. Thế giới đã có một số sản phẩm có chứa isoquercetin như: isoquercetin with bioperine, isoquercetin 100 mg, α-glycosyl isoquercetin, EMIQ… đây là các sản phẩm của nước ngoài có giá thành cao.

Nhằm hướng đến chủ động phát triển thị trường trong nước về nguyên liệu isoquercetin và sử dụng trong thực phẩm bổ sung dinh dưỡng, với tính khả dụng sinh học cao hơn rutin thông thường. Cơ quan chủ trì Trung tâm nhiệt đới Việt Nga thuộc Bộ Quốc Phòng cùng phối hợp với Chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn Thu Hoài thực hiện “Nghiên cứu chuyển hóa rutin thành isoquercetin bằng vi sinh vật và ứng dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng” với mục tiêu: Xây dựng được quy trình công nghệ và mô hình thiết bị chuyển hóa rutin thành isoquercetin quy mô ≥ 500 gam sản phẩm/mẻ và ứng dụng isoquercetin sản xuất thực phẩm chức năng dạng viên.

Trong số 52 chủng nấm phân lập từ mẫu hoa Hòe và mẫu đất tại khu vực trồng hoa thuộc 2 tỉnh Thái Bình và Nam Định có 09 chủng nấm sinh trưởng khá tốt với kính thước đường kính khuẩn lạc từ 2,6 - 5,6 cm. Trong đó chủng nấm Aspergillus niger NH57 có khả năng sinh α-l-rhamnosidase (Rha) tốt nhất với hoạt độ enzyme 0,22 U/ml. Tuy nhiên, các chủng vi sinh vật trong tự nhiên thường có hoạt tính thấp và dễ bị mất hoạt tính trong quá trình bảo 4 quản. Vì vậy, để tăng hoạt tính chúng tôi sử dụng tác nhân gây đột biến để tạo biến chủng có khả năng khả năng sinh α-l-rhamnosidase vượt trội hơn.

Sử dụng đèn UV bước sóng 254 nm, công suất đèn 40 W trong 80 phút, sàng lọc được 23 chủng đột biến. Trong đó chủng A. niger ĐB20.8 có hoạt tính enzyme cao nhất đạt 0,37 U/ml cao gấp 1,68 lần so với chủng gốc A. niger NH57.

Tiếp tục sử dụng tác nhân NTG gây đột biến chủng A. niger ĐB20.8 với nồng độ và thời gian khác nhau. Thu được chủng A. niger ĐH51 cho hoạt độ cao nhất đạt 0,45 U/ml (cao gấp 1,23 lần chủng đối chứng ĐB20.8, cao gấp 1,96 lần chủng gốc NH57). Chủng A. niger ĐH51 tiếp tục được sử dụng để tối ưu môi trường và các điều kiện lên men để cho hoạt tính enzyme Rha cao hơn.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau:

Sàng lọc, tuyển chọn được chủng nấm sợi Aspergillus niger ĐH51 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Rha khác nhau phụ thuộc vào thể tích lên men. Sử dụng thiết kế Box-Behnken để tối ưu hóa 3 yếu tố: rhamnose, rutin và pH có hưởng đến quá trình lên men (P<0,05) thu nhận được các thông số tối ưu: rhamnose 1,1%; rutin 0,6% và pH 5,7 cho môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme α-L-rhamnosidase từ chủng A. niger ĐH51 đạt hoạt tính 3,67 U/ml trên thiết bị lên men 10 lít Winpact.

Khảo sát, tối ưu các điều điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, oxy hòa tan, thời gian) chủng A. niger ĐH51 đã thu nhận dịch enzyme Rha thô đạt 2,2 U/ml trong môi trường lên men MT3 có thành phần: KCl - 0,5 (g/L); KH2PO4 - 15 (g/L); NH4Cl - 4 (g/L); yeast extract - 5 (g/L); dung dịch Vishniac - 1 mL; MgSO4.7H2O 10% - 5 mL; rhamnose - 1,1 (%); rutin - 0,6 (%); pH 5,7 ở điều kiện lên men: nhiệt độ - 30^oC; tỷ lệ giống 5%; thời gian nuôi cấy - 7 ngày, thể tích 300 lít với tốc độ sục khí đạt 0,8 vvm.

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, các hợp chất polyol làm ức chế enzyme Glc (được sinh ra trong dịch lên men thô) và giữ được hoạt tính của enzyme Rha từ đó xây dựng quy trình chuyển hóa rutin thành isoquercetin nhờ dịch enzyme thô (hoạt độ Rha 0,4 U/ml) qua hai pha: (i) tiền xử lý dịch enzyme thô có bổ sung Sorbitol 70%, nhiệt độ 72^oC/90 phút, đệm 1M axetat natri pH=4,7; (ii) bổ sung rutin cho chuyển hóa ở nhiệt độ 70^oC/21 giờ trên 27 thể tích 65 lít đạt hiệu suất chuyển hóa khoảng 79% và khối lượng isoquercetin tạo thành khoảng 938 g/mẻ (tồn tại trong dịch chuyển hóa).

Sản phẩm isoquercetin thô (90,1%) được tinh chế bằng NaOH nhận được sản phẩm tinh (≥95%); cấu trúc của isoquercetin được xác định bằng phổ NMR và HR-ESI-MS.

Đánh giá về độc tính cấp trên động vật thực nghiệm (Chuột nhắt trắng) đã không tìm thấy LD50 của chế phẩm isoquercetin theo đường uống cho dù với liều tối đa (60 g/kg trong 72 giờ). Về độc tính bán trưởng diễn được thử nghiệm với động vật thực nghiệm (Thỏ) khi uống với liều dùng 150mg và 300mg /kg/24 giờ, liên tục trong 42 ngày không làm thay đổi thông số của động vật thực nghiệm: trọng lượng, nhịp tim, chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và hàm lượng hemoglobin), chức năng gan (hoạt độ AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatin).

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 18024/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

Vista.gov.vn